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敲黑板?。。is標(biāo)簽融合蛋白純化常見問題和解決方案全收納

更新時(shí)間:2020-04-16 點(diǎn)擊次數(shù):2901

His標(biāo)簽融合蛋白的純化是借助于層析介質(zhì)上的過渡金屬離子(如Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+等)與His融合蛋白上的His標(biāo)簽的配位作用實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的分離。組氨酸(His)的殘基上帶有1個(gè)咪唑基團(tuán),可以和Ni2+等過渡金屬離子形成配位鍵而選擇性的結(jié)合在金屬離子上,這些金屬離子通過螯合配體固定在層析介質(zhì)上,因此帶有His標(biāo)簽的蛋白可以特異性的吸附在螯合了Ni2+等過渡金屬離子的層析介質(zhì)上,而其他不含His標(biāo)簽的雜質(zhì)蛋白則不能吸附或僅微弱吸附在介質(zhì)上。通過提高緩沖液中的咪唑濃度進(jìn)行競爭性洗脫,可以將His標(biāo)簽融合蛋白從層析介質(zhì)上解吸附下來,從而得到較高純度的目標(biāo)蛋白。

常用的His標(biāo)簽融合蛋白純化的填料有Ni Tanrose 6FF(NTA/IDA)金屬螯合親和填料,但是在使用過程這種常常會出現(xiàn)一些問題,這里就給各位老師介紹下常見問題和解決方案

 

填料清洗

當(dāng)填料使用過程中發(fā)現(xiàn)反壓過高或者填料上面出現(xiàn)明顯的污染時(shí),需要進(jìn)行在位清洗操作 (Cleaning-in-Place,CIP)。

建議按照下面操作去除填料上殘留的污染物,如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。

 

去除強(qiáng)疏水結(jié)合的蛋白,脂蛋白和脂類

通過使用 30%異丙醇清洗 5-10 個(gè)柱體積,接觸時(shí)間為 15-20 分鐘可以去除此類污染物。然后,再使用 10 倍柱體積的去離子水清洗。也可以選擇使用含有去污劑的酸性或堿性溶液, 清洗填料 2 倍柱體積。例如,含有 0.1–0.5% 非離子去污劑的 0.1 M 醋酸溶液,接觸時(shí)間 為 1–2 小時(shí)。去污劑處理后,需要使用 70%的乙醇清洗 5 個(gè)柱體積,以*去除去污劑。后使用 10 倍柱體積的去離子水清洗。

 

去除離子作用結(jié)合的蛋白

使用 1.5M NaCl 溶液接觸時(shí)間為 10-15 分鐘清洗。然后,再使用去離子水清洗 10 個(gè)柱體 積。

 

填料再生

組氨酸標(biāo)簽蛋白親和純化填料所帶的鎳離子不需要經(jīng)常螯合去除和重新掛鎳離子。當(dāng)填料使 用過程中發(fā)現(xiàn)顏色變淺,或者填料載量明顯變低時(shí),需要進(jìn)行對填料進(jìn)行鎳離子剝離和重新 掛鎳離子,也就是填料再生。將填料裝填在合適的層析柱內(nèi),按照下面操作流程進(jìn)行鎳離子 剝離和重新掛鎳離子。

1) 使用 0.2 M 醋酸溶液(含 6 M GuHCl)清洗 2 倍柱體積;

2) 使用去離子水清洗 5 倍柱體積;

3) 使用 2% SDS 清洗 3 倍柱體積;

4) 使用去離子水清洗 5 倍柱體積;

5) 使用乙醇清洗 5 倍柱體積;

6) 使用去離子水清洗 5 倍柱體積;

7) 使用 100 mM EDTA (pH 8.0)清洗 5 倍柱體積;

8) 使用去離子水清洗 5 倍柱體積;

9) 使用 100 mM NiSO4 清洗 5 倍柱體積;

10) 使用去離子水清洗 10 倍柱體積;填料再生后,可以立即使用,也可以保存在 20%的乙醇中,置于 4°C 保存。

 

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