四氫呋喃(THF)是反相色譜中洗脫能力極強(qiáng)的溶劑，比甲醇和乙腈都強(qiáng)很多。在流動相中加入THF能改善某些難分離的物質(zhì)對的分離度。但THF不穩(wěn)定，容易降解生成具有很強(qiáng)反應(yīng)活性的過氧化物，能與分析物反應(yīng)生成新化合物，導(dǎo)致拖尾、峰分裂和鬼峰產(chǎn)生。高反應(yīng)活性的過氧化物還可以和填料固定相發(fā)生化學(xué)作用，這個過氧化物對柱子會有損傷，而且這種損傷是隨時間累積的。THF保質(zhì)期一般規(guī)定是6個月，放得越久，里面產(chǎn)生的過氧化物含量越大，應(yīng)該避免使用生產(chǎn)日期已很久的THF溶劑，而且最好將THF冷藏、干燥和避光保存，使用前最好能檢測一下過氧化物的含量。

在反相色譜中隨著pH的增加，酸性化合物保留時間縮短，而堿性化合物延長；

緩沖液可以緩沖溶液pH的改變，緩沖液的定義是加入少量的酸或堿時能緩沖pH，就是說添加酸或堿時pH的變化很小。這個保持pH的能力就叫做緩沖能力，它是由緩沖液的濃度和緩沖鹽的pKa決定的，緩沖鹽在pKa附近的緩沖能力最大。表1列出的是液相中一些常用的緩沖鹽的pKa。注意這是在水中測的，沒有加有機(jī)溶劑。當(dāng)加入有機(jī)溶劑時，pKa會有所變化，但是通常所有化合物的pKa，包括你的分析物的pKa都會有一樣的變化。

對于液相常用濃度來說，緩沖液應(yīng)維持在緩沖鹽的pKa的1.5個pH單位左右，當(dāng)濃度特別稀的時候，如低于5mM，就要把范圍縮小，大概+/-1個pH單位。

表1：常用緩沖鹽的pKa值（25℃）

建議在開發(fā)方法的時候首先要選擇緩沖鹽和 pH范圍，然后用溶液的選擇性微調(diào)分離。這個策略快速而高效，而且可以讓你避免陷入緩沖液pH的泥潭。

1）建議溫度設(shè)置在25℃-40℃，適當(dāng)?shù)闹鶞乇３至己玫谋Ａ魰r間的重現(xiàn)性，一定程度上提高柱效，增加分離度。

2）柱溫過低，流動相的粘度下降，色譜柱的背壓降低。

3）柱溫太高，與檢測器之間溫差太大，使峰變形，加快離子對試劑或緩沖鹽對硅膠基質(zhì)的攻擊，硅膠溶解，縮短色譜柱的壽命；柱溫太低，使得需要制冷的柱溫箱，硬件要求太高，不利于方法的推廣。

4）溫度的改變會導(dǎo)致保留時間漂移，如果儀器自動進(jìn)樣過夜或過周末，就會發(fā)現(xiàn)保留時間隨著實驗室溫度的改變而產(chǎn)生漂移，顯然這種問題用柱溫箱就可以避免。 

1）檢測器對樣品和流動相的吸收差值就是峰的響應(yīng)值，溶劑峰就是配置樣品的溶劑進(jìn)入系統(tǒng)后，所產(chǎn)生的吸收與流動相吸收的差值，一般是最前面的峰。

2）只要進(jìn)樣就會有系統(tǒng)峰出現(xiàn)，和使用什么溶劑沒有什么關(guān)系，如果是梯度，一般在梯度回到起始比例平衡系統(tǒng)的時候也會有系統(tǒng)峰，任何物質(zhì)都不應(yīng)該在這之后出峰。

3）溶劑峰與檢測時的波長有關(guān)系，波長的選擇可以使溶劑峰出現(xiàn)或隱蔽。

4）流動相和稀釋劑選擇的時候一般就要求使用在檢測波長沒有響應(yīng)或響應(yīng)很低的試劑，選擇稀釋劑的時候應(yīng)盡可能的選擇流動相。

如果倒峰并不干擾試驗，所以，只要忽視它就可以了。當(dāng)然，如果你在控制環(huán)境指標(biāo)，那么就要仔細(xì)考慮了。

倒峰是溶劑在該波長下比流動相的吸收更弱，所以有峰就代表可能有物質(zhì)吸收。峰代表著樣品與流動相的差別，與正峰還是倒峰，是否保留無關(guān)。對于我們大部分人來說，并不擔(dān)心這一點。我們知道這只是由于溶液與流動相的差異導(dǎo)致的。因此我們要做的是找出是什么導(dǎo)致了圖譜中出現(xiàn)了額外的峰。這個峰是倒的給我們提供了有用的信息，這些峰是有樣品溶液與流動相的差別導(dǎo)致的。有可能是成分不同，也有可能是pH不一樣。只有非常小心的用流動相配制樣品，才能避免出現(xiàn)倒峰。

要確定那個多出來的峰時來源于外來物還是其他地方，只要進(jìn)一個標(biāo)準(zhǔn)品就好了。如果是外來物質(zhì)的峰，那么在標(biāo)準(zhǔn)品中就不會有峰。這個峰在進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)品甚至是流動相的時候都有。如果換了樣品還是出現(xiàn)這種現(xiàn)象，那么就應(yīng)該把樣品排除嫌疑范圍了。所以，要關(guān)注到儀器或者流動相本身了。如果多出來的峰是正峰，要考慮進(jìn)樣器，注射器，樣品瓶蓋或類似的有沒有污染。流動相本身和所有與其接觸的部件都有很大可能是問題的根源。

關(guān)于漂移問題：

1）溫度控制不好，解決方法是采用恒溫裝置，保持柱溫恒定。

2）流動相發(fā)生變化，解決辦法是防止流動相發(fā)生蒸發(fā)、反應(yīng)等。

3）柱子未平衡好，需對柱子進(jìn)行更長時間的平衡。

關(guān)于快速變化問題：

1）流速發(fā)生變化，解決辦法是重新設(shè)定流速，使之保持穩(wěn)定。

2）泵中有氣泡，可通過排氣等操作將氣泡趕出。

3）流動相不合適，解決辦法為改換合適的流動相或預(yù)先混合流動相。

如果你是手動進(jìn)樣，確定下你是不是忘了扳動六通閥（使用的進(jìn)樣器是六通閥），然后檢查下色譜柱壓力是否正常（有沒存在沒打起液體的情況，是否有漏液現(xiàn)象），最后復(fù)查一下分析方法（如流動相配比、檢測波長、樣品配制濃度等）是否可靠。分析方法是否適合待測樣品，是否存在保留過強(qiáng)導(dǎo)致未洗脫的情況。

這很有可能是流通池內(nèi)有氣泡。請先停泵來進(jìn)行確認(rèn)，如果毛剌消失，則很有可能是由于流動池內(nèi)有氣泡。需要沖洗流動池。如果毛剌仍然存在，則需檢查檢測器本身的電噪音有關(guān)，或者色譜內(nèi)部有污染；若儀器系統(tǒng)進(jìn)入氣泡，可以用純的異丙醇或者純甲醇有機(jī)相進(jìn)行沖洗排除，色譜柱污染，故對色譜柱進(jìn)行強(qiáng)洗脫溶劑進(jìn)行沖洗。

1)柱溫波動：(即使是很小的溫度變化都會引起基線的波動。通常影響示差檢測器、電導(dǎo)檢測器、較低靈敏度的紫外檢測器或其它光電類檢測器)。控制好柱子和流動相的溫度，在檢測器之前使用熱交換器。

2)流動相不均勻：(流動相條件變化引起的基線漂移大于溫度導(dǎo)致的漂移)。使用HPLC級的溶劑，高純度的鹽和添加劑，流動相在使用前進(jìn)行脫氣，使用中使用氦氣。

3)流通池被污染或有氣體：用甲醇或其他強(qiáng)極性溶劑沖洗流通池。如有需要，可以用硝酸(不要用鹽酸)。

4)檢測器出口阻塞：(高壓造成流通池窗口破裂，產(chǎn)生噪音基線)取出阻塞物或更換管子。參考檢測器手冊更換流通池窗。

5)流動相配比不當(dāng)或流速變化：更改配比或流速。為避免這個問題可定期檢查流動相組成及流速。

6)柱平衡慢特別是流動相發(fā)生變化：用中等強(qiáng)度的溶劑進(jìn)行沖洗,更改流動相時，在分析前用10~20倍體積的新流動相對柱子進(jìn)行沖洗。

7)流動相污染、變質(zhì)或由低品質(zhì)溶劑配成：檢查流動相的組成。使用高品質(zhì)的化學(xué)試劑及 HPLC 級的溶劑。

8)樣品中有強(qiáng)保留的物質(zhì)(高K值)以饅頭峰樣被洗脫出，從而表現(xiàn)出一個逐升高的基線：使用保護(hù)柱，如有必要,在進(jìn)樣之間或在分析過程中,定期用強(qiáng)溶劑沖洗柱子。

9)使用循環(huán)溶劑，但檢測器未調(diào)整：重新設(shè)定基線。當(dāng)檢測器動力學(xué)范圍發(fā)生變化時，使用新的流動相。

10)檢測器沒有設(shè)定在最大吸收波長處：將波長調(diào)整至最大吸收波長處。

可能的原因：

1）泵頭中有氣泡

2）單向閥順壞

3）柱塞密封圈損壞

4）脫氣不充分

5）系統(tǒng)漏液

6）使用了梯度洗脫