蛋白與配體能否結(jié)合、結(jié)合的強(qiáng)弱會(huì)直接影響蛋白檢測或純化實(shí)驗(yàn)的成敗。此篇文章由月旭科技首xi科學(xué)家王國斌博士執(zhí)筆,對蛋白結(jié)合和解離常數(shù)進(jìn)行了較為系統(tǒng)的講述。
蛋白和配體結(jié)合的強(qiáng)弱不同,對于蛋白檢測以及親和分離純化實(shí)驗(yàn)有顯著影響。在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)考慮這種結(jié)合強(qiáng)弱影響,以便采用合適的蛋白或配體濃度(包括zui低檢測限濃度),估算結(jié)合時(shí)間,獲得最佳并且實(shí)用的結(jié)果。 這對于室溫下易失去活性,或希望盡可能保持最高活性蛋白的純化尤為重要。
常規(guī)的蛋白檢測方法,比如ELISA,只能測定實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的蛋白結(jié)合數(shù)值,不能跟蹤整個(gè)過程。這不利于獲取結(jié)合的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù),阻礙了實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化。自從上個(gè)世紀(jì)90年代Biacore商品化surface plasmon resonance技術(shù)后,目前已有幾種生物傳感器技術(shù),能夠跟蹤蛋白和配基的real-time結(jié)合過程,檢測結(jié)合的全部過程,給出結(jié)合的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。下圖是我在SRU Biosystems用光學(xué)生物傳感測定蛋白A和不同濃度人類IgG隨時(shí)間變化的結(jié)合曲線。IgG濃度在100μg/mL時(shí),結(jié)合在2-3分鐘內(nèi)迅速上升后,緩慢增加。在濃度減小時(shí),結(jié)合速度變慢。濃度在6.25μg/mL時(shí),結(jié)合在180分鐘內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定地增加。濃度小于1μg/mL時(shí),結(jié)合仍然進(jìn)行,但是十分緩慢。
絕大多數(shù)生化實(shí)驗(yàn)室,沒有real-time跟蹤檢測手段,蛋白檢測或者純化過程中,確定蛋白的濃度和結(jié)合時(shí)間通常根據(jù)結(jié)合的強(qiáng)弱來確定,而結(jié)合強(qiáng)弱是通過解離常數(shù)來判斷的。
在化學(xué)、生物化學(xué)中,解離常數(shù)(KD) 是一種反應(yīng)的平衡常數(shù),用于測量較大物體可逆地分離(解離)成較小成分的傾向。解離常數(shù)是結(jié)合常數(shù)的倒數(shù)。 雖然解離常數(shù)是動(dòng)力學(xué)理論的參數(shù), 但是它在生物化學(xué),尤其實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上有現(xiàn)實(shí)意義的指導(dǎo)作用。
對于一個(gè)可逆的蛋白結(jié)合過程
(1)P+L?P L
PL是蛋白P和配體L的親和產(chǎn)物。解離常數(shù)KD定義為
(2)KD=[P]e[L]e/[PL]_e=1/KA
其中[P]e’[L]e和[PL]e分別是到達(dá)平衡時(shí),P、L和結(jié)合物PL的濃度。KA是結(jié)合常數(shù)。結(jié)合率?定義為蛋白P與配體L結(jié)合成PL的比例。
(3)?=[PL]_e/[P]t
[P]t是起始的蛋白P總濃度。平衡時(shí)蛋白濃度
(4)[P]e= [P]t-[PL]e
等式(2)變成
(5) KD=([P]t-[PL]_e)[L]e/[PL]
等式(5)變成
(6) [PL]_e/[P]t=[L]e/(KD+[L]e)
結(jié)合率?轉(zhuǎn)化為
(7) ?=[PL]_e/[P]t=[L]e/(KD+[L]e)
平衡時(shí)省余未結(jié)合配體濃度
(8)[L]e=? KD/(1-?)
當(dāng)?shù)鞍譒有一半結(jié)合時(shí),?=0.5
(9) [L]e=KD
最后平衡狀態(tài)結(jié)合配體的濃度就等于解離常數(shù)。下面闡述其實(shí)用價(jià)值。
例如KD為1nM時(shí),最后剩余的配基平衡濃度為1nM,一半的蛋白會(huì)與配體結(jié)合(?=0.5)。KD為5nM時(shí),最后剩余的配體平衡濃度為5nM時(shí),一半的蛋白會(huì)與配體結(jié)合(?=0.5)。如果想要提高蛋白結(jié)合率到六成(?=0.6圖中紫線),就要增加配基濃度,達(dá)到最后配基平衡濃度分別為1.5nM(KD=1nM)和7.5nM(KD=5nM)。對于蛋白A填料來說,配體就是抗體,不同動(dòng)物/總類的抗體有不同的KD。如果給與足夠時(shí)間,結(jié)合達(dá)到平衡后(靜態(tài)載量),沒結(jié)合抗體的濃度也不同。KD小,會(huì)有更高的靜態(tài)載量,分離得更*。 要想提高低KD抗體的載量,只能提高填料表面蛋白A的密度。如果時(shí)間短,沒有達(dá)到最后的結(jié)合平衡,現(xiàn)實(shí)的例子就是抗體流過蛋白A填料柱。在相同時(shí)間里,KD小的,會(huì)有更多的抗體與蛋白A結(jié)合。對于同樣的KD流速低,時(shí)間長,動(dòng)態(tài)載量也會(huì)更高。
反之, 在最后配體平衡濃度為8nM(圖中紅線)時(shí),KD?。?nM)的蛋白結(jié)合率能達(dá)到0.89,而KD大(5nM)的蛋白結(jié)合率只有0.62。 這對于無蛋白檢測時(shí),試劑濃度選定有幫助。比如ELISA的二抗(檢測抗體)或者熒光標(biāo)記的二抗以及鏈霉親和素(Streptavidin)濃度確定后,KD對蛋白(被檢測物)的濃度測定的影響就顯而易見。KD小的被檢測蛋白,比如蛋白A或者蛋白A的填料,結(jié)合率高,檢測結(jié)果更準(zhǔn)確。如果KD較大,就要提高二抗?jié)舛?,以確保檢測數(shù)據(jù)可信度,或者縮短實(shí)驗(yàn)周期。
在分子生物學(xué)上,KD<10-8M (10nM或者0.01μM)屬于強(qiáng)結(jié)合; 10-4M>KD>10-8M屬于中等結(jié)合;KD>10-4M (0.1mM)屬于弱結(jié)合。蛋白A與不同種類抗體結(jié)合的強(qiáng)弱不同。例如protein A與人類IgG1、IgG2和IgG4的KD約為2×10?9M,屬于強(qiáng)結(jié)合。下表列出不同抗體與蛋白A結(jié)合的強(qiáng)弱情況。蛋白檢測,分離純化過程中,應(yīng)該參照結(jié)合強(qiáng)弱,設(shè)計(jì)操作方案。
鏈霉親和素(streptavidin)是生物化學(xué)常用的試劑。它于生物素(biotin)結(jié)合的KD非常小,僅為~10?14M。 強(qiáng)度與共價(jià)鍵類似。前文介紹過,鏈霉親和素是非常穩(wěn)定50KD蛋白,經(jīng)常用來與熒光、紅外、ELISA標(biāo)記等化學(xué)結(jié)合而不失去其生物活性。生物素是分子量244,帶有羧基的小分子。 容易與蛋白化學(xué)結(jié)合。這樣帶有標(biāo)記的鏈霉親和素,與帶有生物素的蛋白結(jié)合,從而避免直接標(biāo)記蛋白。鏈霉親和素和生物素KD小。對比于直接標(biāo)記二抗的方法,采用標(biāo)記的鏈霉親和素-生物素的方法用量小、時(shí)間短,達(dá)到準(zhǔn)確檢測的目的?;谶@種原因,標(biāo)記的鏈霉親和素、化學(xué)活化的生物素以及生物素結(jié)合的二抗等蛋白檢測試劑,比較容易購買,這對于實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)非常便利。