日常工作中，經(jīng)常遇到老師咨詢硅膠單體表面的硅烷鍵合方式，是單鍵鍵合、雙鍵鍵合還是三鍵鍵和呢？填料表面是否有活性硅醇基，有沒有封端？碳鏈上是否嵌入極性官能團(tuán)，是哪種官能團(tuán)？在有些項目標(biāo)準(zhǔn)上，要求固定相是堿基失活硅膠。熟悉固定相鍵合方式及其修飾，有助于了解色譜柱的使用條件，選擇合適的色譜柱。

制備反相色譜柱填料常用的方法是有機(jī)硅烷和硅膠表面的硅醇基上發(fā)生共價反應(yīng)，來“鍵合"生成固定相或者配合基R：

X3-Si-R+≡Si-OH→≡Si-O-Si（X2）-R+HX

（硅烷）（硅烷醇）（最后的固定相）

HPLC柱子的制備可通過幾種不同的硅烷-硅膠反應(yīng)來實現(xiàn)。單體相是反相柱子里使用zui廣泛的技術(shù)，即一個硅烷分子和硅醇基反應(yīng)。這種一對一鍵合，使生成的鍵合相相對完善并且具有很好的重現(xiàn)性。這樣制作的填料通常會具有zui高的柱效，因為固定相層相對不擁擠，因此溶質(zhì)分子能夠快速擴(kuò)散進(jìn)出固定相。相反，多官能團(tuán)的、高度聚合的固定相則表現(xiàn)出較低的溶質(zhì)擴(kuò)散速度和較低的柱效，尤其是在流動相流速較高的情況下。

目前單體的硅烷-硅膠鍵合技術(shù)主要分為四種：單鍵鍵合（Ultimate^® XB-C18）、雙鍵鍵合（Sunfire C18）、三鍵鍵合（Ultimate^® PAH）、雙齒鍵合（ZORBAX Extend C18）。單鍵鍵合有利于提高傳質(zhì)速率，加快色譜柱平衡，但在低pH條件下長期使用時，單鍵鍵合相易流失，在色譜圖上表現(xiàn)為保留時間縮短。而使用多鍵鍵合的方式（雙鍵鍵合、三鍵鍵合和雙齒鍵合）可以提高固定相在低pH條件下的穩(wěn)定性。

因為存在結(jié)構(gòu)位阻，硅膠表面的硅醇基無法wan全與硅烷分子鍵合，而殘留的硅醇基，可能與堿性化合物發(fā)生次級離子交換作用，導(dǎo)致峰形不佳，因此常采用體積較小的TMS（如三甲基硅烷）或者其他技術(shù)封端，使填料表面盡可能的減小殘留硅醇基。但是TMS在pH較低時容易被水解和破壞，這會造成保留時間和選擇性發(fā)生改變。另一方面來說，封端填料提高了色譜柱在堿性條件下的穩(wěn)定性，降低柱流失，并有利于色譜柱對極性和堿性化合物的分離、提供良好的峰形。

在硅膠表面的十八烷基的側(cè)鏈上引入甲基、異丙基或異丁基，可以極大程度的屏蔽硅膠表面硅醇基的作用?？臻g保護(hù)對于低pH的分離實驗非常有幫助，避免了低pH條件下O-Si鍵的斷裂，但不能用在高pH條件下。具有空間保護(hù)功能的固定相可以以多種配合基的形式存在（比如，C8、C18、氰基、苯基），每個配合基在流動相較低的pH條件下均能保持較高的穩(wěn)定性（pH低至0.8）。常見該類型色譜柱如月旭Ultimate^® LP系列色譜柱。

一般反相色譜柱對強極性和強堿性物質(zhì)分離較差，在反相固定相的碳鏈中嵌入極性基團(tuán)（如脲基、酰胺基、醚基或甲酸酯基），提高對此類物質(zhì)的選擇性，同時極性基團(tuán)屏蔽了硅膠表面的硅醇基作用，可極大改善峰形，在測定堿性物質(zhì)時不拖尾。典型代表如采用酰胺基團(tuán)的Ultimate^® Polar-RP色譜柱。

另外碳鏈中存在極性基團(tuán)，能使固定相的親水性濕潤性增強，用到95%以上的高水流動相時，不會發(fā)生相塌陷。具有與普通的反相C18和C8柱不同的選擇性，特別是對于酚類等極性物質(zhì)。