目前對于藥品中含有的極少量物質(zhì)(如基因毒性雜質(zhì)等),在對其進行痕量分析時,通常采用的檢測手段是:利用先進的液質(zhì)聯(lián)用(如LC-MS或LC-MS/MS等)、氣質(zhì)聯(lián)用(如GC-MS或GC-MS/MS等)設備,對其微量物質(zhì)進行檢測時所需液相色譜系統(tǒng)可能為更高級的超高效液相色譜儀。
如檢測藥物中含有亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)NDMA,根據(jù)不同原料藥的性質(zhì)不同,目前國際上公布的方法主要有:GC-MS法、GC-MS/MS法、UPLC-APCI-MS/MS法,HPLC-UV法(EDQM公布)。國內(nèi)官fang公布的方法主要有GC-MS法、GC-MS/MS法、UPLC-APCI-MS/MS法,如中國藥典2015年版二部推薦使用GC-MS法(詳見《纈沙坦》原料中N-ya硝基二甲胺的含量測定方法),不推薦使用HPLC-UV法,因為HPLC-UV法靈敏度比質(zhì)譜儀的靈敏度差很多,而且專屬性差些,容易受到檢測干擾,故HPLC-UV法具有很大的局限性,只能準確測定那些含量相對較高的物質(zhì)。
然而現(xiàn)有檢測技術中:
● 質(zhì)譜儀價格昂貴,運行成本高,所需的試劑要求高,抗干擾能力差,維護保養(yǎng)費用很高,同時對質(zhì)譜儀操作人員的水平要求非常高,需要高層次的人才方能準確操控。故質(zhì)譜儀普及率非常低,一般企業(yè)較少購置,對于需要使用質(zhì)譜儀進行痕量分析時只能委托特定的機構使用質(zhì)譜儀進行檢測。
● 氣相色譜/質(zhì)譜法操作過程繁瑣,經(jīng)過前處理后樣品損失嚴重。
● 高效液相色譜儀價格便宜,操作容易,覆蓋面廣,一般企業(yè)均很常見。但是單純使用HPLC-UV法進行檢測含量極少的物質(zhì)時,其靈敏度差,不能準確定量檢測出復雜原料藥中含量極低的物質(zhì),且檢測過程中目標化合物所受干擾亦較大,目標化合物與其它雜峰之間的分離難度較大。
在缺少質(zhì)譜儀的情況下,
中國藥企如何走出雜質(zhì)痕量檢測的困境呢?
基于以上痕量檢測的難點,沒有質(zhì)譜儀的幫助,實驗人員是否可以通過長期大量的研究,不斷嘗試各項色譜條件的調(diào)試,諸如:流動相試劑的組成、梯度程序設置、柱溫、流速的改變等。
特別是色譜柱的篩選,如雖然同樣都是十八烷基硅烷鍵合色譜柱,可以嘗試不同品牌、不同系列的C18柱,色譜柱間填料的差異會呈現(xiàn)出對樣品的不同選擇性。另外,色譜柱規(guī)格的差異也會帶來不同的檢測效果,如色譜柱的內(nèi)徑越細靈敏度越高、色譜柱越長柱效越高、填料的粒徑越小分離效率越高……光是色譜柱就有多達7項以上的可調(diào)節(jié)參數(shù)。
最近就有一家藥企嘗試走了這樣一條路,對尼扎替丁中所含痕量雜質(zhì)N-ya硝基二甲胺(NDMA)檢測方法進行了長期研究,最終探索出一種采用HPLC法測定樣品中NDMA的方法,該方法簡便快速,且測定結果準確。
這就是湖南威特制藥股份有限公司。在他們的開發(fā)報告中記錄到:
“我們首先嘗試解決了色譜分離的問題,因供試品溶液濃度很大,其他峰對目標物質(zhì)NDMA的干擾較多,在摸索優(yōu)化檢測方法的過程中,對色譜柱的選擇做了大量的工作,既要不被干擾,又要保證峰形正常,且需能夠增加該峰的檢出能力,最后選擇了特定的月旭Ultimate® ODS-3 4.0×250mm,3μm色譜柱,且此型號的色譜柱批間差異較小。保證了該方法成功通過了方法學驗證,并最終獲得了發(fā)明專li授權。”
湖南威特測試了來自至少4個色譜柱廠家的十幾種C18柱,最終月旭Ultimate® ODS-3 4.0×250mm,3μm這款柱子展現(xiàn)了其du特的分離和檢測特性,4.0mm內(nèi)徑具有更高的靈敏度,3μm粒徑也提供了更高的柱效。在這款色譜柱的基礎上,客戶繼續(xù)配合優(yōu)化其他的色譜條件,最終確定了這個簡便快捷,且測定結果準確的HPLC方法。
艱辛的付出,終于獲得了回報。感謝湖南威特為我們示范了超高的液相方法開發(fā)水平,展示了不同色譜條件配合玩轉(zhuǎn)色譜柱,為方法開發(fā)帶來的無限可能!
參考文獻:
一種HPLC法檢測尼扎替丁中N-ya硝基二甲胺的方法
(專li號:ZL202110045224.4;授權公告日:2023.07.28)
附:Ultimate® ODS-3色譜柱技術參數(shù)