什么是離子排阻色譜?
離子排阻色譜又叫作離子排阻分配色譜,離子節(jié)制分配色譜。離子排阻色譜分離測定的是低電離度的分子,而不是離子,分離過程在離子交換柱上實現(xiàn)。
離子交換柱
色譜柱作為分離機(jī)制中重要的一員,承擔(dān)著固定相的角色,是我們必須了解的重點(diǎn)!
本文暫且以月旭Xtimate® Sugar-H柱為例,來闡述分離原理。該色譜柱采用磺化苯乙烯二乙烯基苯共聚氫型強(qiáng)陽離子交換填料,交聯(lián)度8%,具有耐酸、耐高溫的特點(diǎn)。樹脂中二乙烯基苯的含量影響弱酸的保留,一般而言,交聯(lián)度越低,就有越多的電解質(zhì)進(jìn)入到樹脂內(nèi)部,使弱酸的保留增強(qiáng)。
離子排阻色譜原理
由于道南電勢的存在,離子交換劑中固定不擴(kuò)散的離子可排斥帶同種電荷的小離子擴(kuò)散進(jìn)入樹脂相。被排阻的離子快速通過色譜柱,無保留或保留值很小;非離子溶質(zhì)則被分配、保留并實現(xiàn)分離。強(qiáng)酸陰離子受阻于陽離子交換樹脂之外,而低電離度的弱酸分子能夠進(jìn)入到樹脂內(nèi)部,且通過溶質(zhì)與樹脂功能團(tuán)之間的極性相互作用和溶質(zhì)與樹脂基體間的非極性相互作用被固定相所保留。
因此,在離子排阻色譜中溶質(zhì)保留的選擇性產(chǎn)生于:
溶質(zhì)受阻程度的不同,一般歸因于pKa差異,在不同的pH條件下物質(zhì)的電離程度不同。
溶質(zhì)與樹脂功能團(tuán)間極性相互作用的差異。
溶質(zhì)與樹脂基體間非極性相互作用的差異。
可通過調(diào)節(jié)柱溫改變電離平衡活躍程度,改善分離度。
實例分析
月旭Xtimate® Sugar-H(7.8×300mm,5μm)分離弱酸鈣鹽和醋酸賴氨酸,流動相為稀硫酸溶液。在分離弱酸陰離子時,為了抑制電離,將陰離子轉(zhuǎn)化為游離的分子,使用稀酸作為流動相。調(diào)節(jié)流動相pH可改變分析物的電離程度即受阻程度,實現(xiàn)各物質(zhì)的分離。
六種分析物結(jié)構(gòu)如下
觀察以上結(jié)構(gòu),我們發(fā)現(xiàn):此類分析物是連接不同R基團(tuán)的有機(jī)酸分子R-C00H,擁有不同的pKa值,在不同的pH下呈現(xiàn)不同的分子-離子平衡狀態(tài)。所以我們設(shè)想通過離子排阻色譜填料,對不同結(jié)構(gòu)的分析物產(chǎn)生的排阻情況和分配效果不同,從而達(dá)到分離,這樣的一個思路。
接下來我們嘗試不同pH流動相的分離效果
1. 流動相pH=1.99:
分析:僅分離五個峰,醋酸賴氨酸未分離。
2. 流動相pH=1.69:
分析:pH減小,在色譜柱中后四峰對應(yīng)的物質(zhì)質(zhì)子化程度增強(qiáng),電離程度減弱,低電離度的弱酸分子進(jìn)入到樹脂內(nèi)部被保留分配,后4個峰保留增強(qiáng),醋酸賴氨酸得以分離(8.5min)。但倒數(shù)2,3峰出現(xiàn)重合,改變柱溫?zé)o更優(yōu)結(jié)果。醋酸賴氨酸8.5min后有一定空間將后四個峰左移,可能分離后四個峰。嘗試將流動相pH調(diào)至(1.69-1.99)之間。
3. 調(diào)整流動相pH=1.85:
分析:后四個峰太靠左,需微調(diào)pH使得峰向右移。
考察更低pH時是否能極大增強(qiáng)保留使后四峰分離。
4-1. 調(diào)整流動相pH=1.40:
4-2. 調(diào)整流動相pH=1.57:
分析:更低pH無法達(dá)到分離目標(biāo)??v觀以上1-4結(jié)果,當(dāng)降低流動相pH≦1.99時,不管pH變化為多少,后四峰保留時間均在8.5min至14min之間,僅先后次序發(fā)生改變。醋酸賴氨酸保留時間幾乎不變,處于8.5min前后。pH≦1.99時弱酸陰離子質(zhì)子化程度比較大,幾乎達(dá)到極限,可供分離的調(diào)整空間無幾。需改變思路。
當(dāng)pH升高時,調(diào)節(jié)各弱酸陰離子的電離平衡,保留一定的離子受阻率,峰保留減弱提前出峰,若醋酸賴氨酸保留時間仍不變,則可能使醋酸賴氨酸峰出在后四峰的出峰間隙中。
5. 調(diào)整流動相pH=2.0,柱溫50度:
分析:當(dāng)pH升高時,峰保留減弱提前出峰,醋酸賴氨酸保留時間仍不變,處于8.5min,使醋酸賴氨酸峰出在后四峰的出峰間隙中的思路可行。
6. 調(diào)整流動相pH=2.5,柱溫50度:
分析:僅分離五個峰,醋酸賴氨酸未分離。
折中取流動相。
7-1. pH=2.3,柱溫50度和60度:
7-2. pH=2.35,柱溫50度和60度:
分析:倒數(shù)第二峰對流動相pH敏感,且與前后峰接近,調(diào)整空間受到限制,需改變思路。
當(dāng)pH>2.0時,最末峰出峰范圍固定于9-11min。目前已知當(dāng)pH升高時,其他四種物質(zhì)出峰會提前,可以考慮將其他四個峰前移,使醋酸賴氨酸峰出在倒數(shù)第二的出峰位置。參考6的結(jié)果(pH=2.5,柱溫50度的分離情況),推測當(dāng)pH>2.5時,前4個峰前移,醋酸賴氨酸得以與重合的倒數(shù)第二個峰分離。因倒數(shù)第二峰的出峰時間對pH敏感,只能微調(diào)pH進(jìn)行嘗試。
8. 調(diào)流動相pH=2.6,柱溫50度和60度:
分析:達(dá)到預(yù)期分離情況,分離度良好。
結(jié)論:當(dāng)我們真正了解離子排阻色譜分離原理后,就可以游刃有余的通過調(diào)節(jié)流動相的pH、柱溫等,來改變樣品保留地選擇性。通過改變色譜條件,調(diào)節(jié)分析物的電離活躍程度,改變離子受阻率,對各個物質(zhì)進(jìn)行分離。你,學(xué)會了嗎?